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一、標(biāo)本采集 2、標(biāo)本確認(rèn) 在采集患者標(biāo)本前必須對(duì)患者進(jìn)行確認(rèn)。標(biāo)本應(yīng)該在患者在場(chǎng)時(shí)標(biāo)記，不能事先標(biāo)記也不能等患者走了之后才標(biāo)記。運(yùn)送到檢驗(yàn)科的標(biāo)本應(yīng)該用粘貼牢固 的標(biāo)簽，至少包括以下信息：患者全名、唯一的編號(hào)、采集日期、采集者的姓名、標(biāo)本類型和檢測(cè)方法。如果使用條形碼，則按條形碼的規(guī)定進(jìn)行標(biāo)識(shí)。 3、申請(qǐng)單 檢測(cè)申請(qǐng)單必須和患者標(biāo)本一起送到實(shí)驗(yàn)室。申請(qǐng)單應(yīng)該包括以下信息：患者全名、唯一的編號(hào)、接受編號(hào)、出生日期、標(biāo)本采集時(shí)間、標(biāo)本類型、檢測(cè) 方法、相關(guān)臨床和實(shí)驗(yàn)室信息、醫(yī)生的姓名、標(biāo)本采集部門、結(jié)算信息和其他信息。在某些情況下，還需要其他的信息。比如基因檢測(cè)要寫明申請(qǐng)檢測(cè)的理由，因?yàn)?檢測(cè)人員要根據(jù)患者的年齡和其他信息來(lái)判斷檢測(cè)項(xiàng)目的選擇是否恰當(dāng)。某些基因檢測(cè)還需要患者同意。 4、標(biāo)本獲得方法 在采集人體組織或體液時(shí)必須戴手套。手套可以防止經(jīng)血液傳播的感染和操作者的脫落細(xì)胞污染標(biāo)本。所有操作都應(yīng)該遵循安全防范規(guī)定（詳見(jiàn)CLSI M29關(guān)于實(shí)驗(yàn)室工作人員防止職業(yè)獲得性感染）。 5、用血漿的凝血檢測(cè)標(biāo)本采集技術(shù) ?。?）設(shè)備 推薦使用血液采集系統(tǒng)將靜脈血標(biāo)本直接收集到含有適當(dāng)抗凝劑的玻璃或塑料容器中。用于凝血檢測(cè)的標(biāo)本應(yīng)該收集在非活性表面的容器中。正確的靜脈 穿刺技術(shù)詳見(jiàn)CLSI H3。典型的采血裝置是一根指針與容器連接。帶翼的針對(duì)嬰兒、兒童、靜脈較小或者經(jīng)常用靜脈扎針者較適用。帶翼的采血針的一頭帶有一個(gè)柔韌的塑料翼，便于 將針頭插進(jìn)血管。針的長(zhǎng)度可根據(jù)需要靈活選擇。無(wú)論是用于真空采血系統(tǒng)還是注射器，過(guò)小的針頭可能會(huì)引起溶血。 用于血凝檢測(cè)的標(biāo)本可以收集到注射器中，注射的內(nèi)表面必須是非活性的（如聚丙烯），注射器內(nèi)應(yīng)該加入適當(dāng)?shù)目鼓齽?。抽血過(guò)程必須在1分鐘內(nèi)完 成，標(biāo)本進(jìn)入注射器后迅速混勻。使用皮下注射器和針頭可能會(huì)引起溶血并且存在安全問(wèn)題。推薦使用小體積注射器（不超過(guò)20ml），若使用大體積的注射器會(huì) 增加凝血的可能。血液可以通過(guò)安全轉(zhuǎn)移裝置從注射器轉(zhuǎn)移到帶橡膠活塞的真空試管中。先將試管用固定裝置固定，不能手拿。然后讓血液緩慢的流入試管中。太快 可能會(huì)引起溶血，影響整個(gè)測(cè)試過(guò)程。轉(zhuǎn)移過(guò)程中不能用力按壓注射器拉桿，這樣容易使試管活塞滑落，血液噴灑。當(dāng)轉(zhuǎn)移完畢將針頭從真空管內(nèi)移出時(shí)應(yīng)該注意防 止注射器中的血液繼續(xù)流出（詳見(jiàn)CLSI M29）。 在某些情況下，用于凝血檢測(cè)的血液標(biāo)本可能從血管輔助裝置（vascular access device，VAD）中抽取，然后用血液收集系統(tǒng)或注射器收集。在使用血管輔助裝置采集靜脈血時(shí)，應(yīng)該確保整個(gè)血液采集系統(tǒng)（VAD、注射器，采血針和 收集裝置）不漏氣，否則會(huì)引起溶血和樣本抽取的體積不對(duì)。盡量不要提前在血液收集管道中注入肝素。如果必須要要用VAD采集標(biāo)本，應(yīng)該考慮到肝素可能造成 的污染和稀釋。如果標(biāo)本收集管道中注入了5ml鹽水，那么前5ml或者VAD的6倍死腔體積的血液應(yīng)該棄去。如果懷疑標(biāo)本可能有肝素污染，檢測(cè)前應(yīng)該去掉 或中和混有的肝素。如果標(biāo)本是從封閉管中抽取，要棄去2倍導(dǎo)管和延伸裝置的死腔體積的血液。 所有含有抗凝劑的收集容器（如試管或注射器）采集完標(biāo)本后都應(yīng)該顛倒混勻3到6次以確保標(biāo)本和抗凝劑充分混勻。不要?jiǎng)×覔u動(dòng)，以免造成溶血或血小板激活聚集，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果錯(cuò)誤。 ?。?）廢棄試管 有人提出了廢棄試管的假說(shuō)，即用于常規(guī)凝血檢測(cè)的標(biāo)本在收集前必須將前一部分血液抽到廢棄試管中并遺棄以避免組織凝血活酶對(duì)結(jié)果的影響。然而， 也有研究表明沒(méi)有使用廢棄管對(duì)凝血酶原時(shí)間（PT）(INR)和活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）的結(jié)果并沒(méi)有影響。也有證據(jù)表明其他的凝血檢測(cè)項(xiàng)目最好 使用廢棄試管。但是至今還沒(méi)有公開發(fā)表的數(shù)據(jù)和文章明確的說(shuō)明使用真空采血裝置時(shí)是否有必要使用廢棄管。使用帶翼的血液采集裝置用于靜脈采血時(shí)，先用凝集 管收集血液然后將血液遺棄，目的在于將標(biāo)本收集試管中的死腔填滿，以保證合適的抗凝劑和血液比例。有的采血中心使用雙注射器技術(shù)采集血凝檢測(cè)標(biāo)本。首先用 不含添加劑的試管采集標(biāo)本，將針頭留在血管里，小心的切換含抗凝劑的注射器以采集，第二管血用于血凝檢測(cè)。 ?。?）標(biāo)本采集容器（試管和注射器） 用于凝血檢測(cè)標(biāo)本收集和保存的容器必須是非活性表面。玻璃容器必須是用高質(zhì)量玻璃做成并且要硅化使其表面是非活性的。塑料容器應(yīng)該是由非活性材料如聚丙烯組成，不能用聚苯乙烯。 如果改變了容器的種類或者廠商，應(yīng)該做一個(gè)平行試驗(yàn)來(lái)評(píng)估不同材質(zhì)或不同廠商生產(chǎn)的試管對(duì)凝血檢測(cè)結(jié)果是否有影響。由于不同容器造成的結(jié)果改變可能對(duì)正常參考值范圍內(nèi)的標(biāo)本不明顯，但是對(duì)超出正常范圍的標(biāo)本明顯。 第二個(gè)試管或抽樣試管也應(yīng)該是由非活性材料如聚丙烯組成，不能用聚苯乙烯。試管必須有適當(dāng)?shù)臉?biāo)記。 ?。?）抗凝劑 凝血檢測(cè)的抗凝劑推薦使用濃度為105~109mmol/L，3.13%~3.2%的二水合檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7?2H2O）。此 外，129mmol/L，3.8%的水合檸檬酸三鈉也可用。但即使檸檬酸鈉的濃度在3.2%~3.8%之間，正常范圍也不同，特別是當(dāng)檢測(cè)值落在參考范圍 外時(shí)，因此實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該規(guī)定檸檬酸鈉的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)濃度。由于3.8%的檸檬酸鈉結(jié)合的鈣更多，因此凝血時(shí)間比使用3.2% 的檸檬酸鈉更長(zhǎng)。 109mmol/L檸檬酸鹽緩沖液含有茶堿、腺苷和雙吡啶（CTAD），可使血小板的活性最小，也可用于凝血檢測(cè)。不能用其他抗凝劑，如草酸鹽、肝素或EDTA。 最近出現(xiàn)了新的抗凝劑pH4.3的0.45mol/L的檸檬酸鈉緩沖液，較強(qiáng)的酸性可穩(wěn)定血漿中的纖維蛋白溶解因子和凝血系統(tǒng)的其他物質(zhì)，如可 溶性的血栓調(diào)節(jié)蛋白和血管性血友病因子（vWF因子）。此外，檸檬酸鹽與蛋白酶抑制劑如D-苯丙氨酰脯氨酰精氨酰氯甲酮（PPACK）結(jié)合可保護(hù)血漿樣本 的完整性。 以前，其他用于彌散性血管內(nèi)溶血（DIC）的非常規(guī)凝血檢測(cè)需要非血漿樣本。由于多價(jià)抗體可能與纖維蛋白原發(fā)生交叉反應(yīng)，用于纖維蛋白降解產(chǎn) 物、纖維蛋白分解產(chǎn)物和纖維蛋白裂解產(chǎn)物檢測(cè)必須使用血清樣本。樣本收集在含有凝血酶和胰蛋白酶抑制劑的試管中，有時(shí)使用立止血酶，因?yàn)樽罱捎诶w維蛋白 降解產(chǎn)物（FDP）單可隆抗體的發(fā)展，避免了與纖維蛋白原的交叉反應(yīng)，使得FDP可用血漿檢測(cè)。有研究顯示，用血清檢測(cè)的舊方法不如用血漿檢測(cè)的新方法準(zhǔn) 確。若凝血塊中結(jié)合了FDP可使FDP值偏低，若血凝塊形成產(chǎn)生了FDP可使結(jié)果偏高。 ?。?）血液與抗凝劑的比例 使用血漿作為標(biāo)本的血凝檢測(cè)，血漿和抗凝劑的體積比試9：1。采集裝置不恰當(dāng)可能使這個(gè)比例降低從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)血漿實(shí)際的填充體積減少 時(shí)，血漿與抗凝劑的比例小于9：1將導(dǎo)致凝血時(shí)間延長(zhǎng)。這種情況下使用3.2%檸檬酸鹽抗凝劑受到的影響較使用3.8%濃度的檸檬酸鹽抗凝劑要小。血漿與 抗凝劑比例不當(dāng)?shù)挠绊戇€取決于APTT和PT反應(yīng)試劑以及試管的體積。除非有特殊說(shuō)明，一般推薦使用90%的填充體積，若小于90%填充體積INR則會(huì)延 長(zhǎng)。兒童用真空試管（不超過(guò)2mL）比標(biāo)準(zhǔn)的5ml試管對(duì)體積的誤差更為敏感。詳見(jiàn)CLSI/NCCLS H1。 ?。?）檸檬酸濃度的調(diào)整 當(dāng)患者的紅細(xì)胞壓積（HCT）大于0.55L/L（55%）時(shí)，檸檬酸的最終濃度應(yīng)該根據(jù)患者的紅細(xì)胞壓積來(lái)調(diào)整，可以使用圖1來(lái)確定標(biāo)本采集 時(shí)所需的抗凝劑和血液的量。HCT增高的患者，血液與抗凝劑的比例小于9：1.試管中的檸檬酸相對(duì)增加，檢測(cè)反應(yīng)中結(jié)合的鈣離子更多，同時(shí)由于抗凝劑的稀 釋效應(yīng)可能延長(zhǎng)凝血時(shí)間。對(duì)于HCT大于0.55的患者，可用下面的公式計(jì)算所需的檸檬酸體積： C=（1.85 x 10-3）（100-HCT）V C是所需的檸檬酸體積；HCT 是指患者紅細(xì)胞壓積；V是采血的量 （如果是5mL的試管，則V是4.5mL）；1.85 x 10-3是常數(shù)（考慮到檸檬酸的體積，血液的體積和檸檬酸的濃度）。 由于患者HCT的高值一般在0.55（55%）-0.65（65%）之間，所以一般情況下可去掉0.1ml的檸檬酸。這樣實(shí)驗(yàn)室可以事先準(zhǔn)備一 些調(diào)整后的采血試管備用。血標(biāo)本和其他凝血標(biāo)本一樣混勻處理。在實(shí)驗(yàn)室的記錄和患者的報(bào)告中應(yīng)該注明患者HCT的增高和檸檬酸經(jīng)過(guò)的調(diào)整。對(duì)于HCT小于 0.20L/L（20%）的標(biāo)本，現(xiàn)在還沒(méi)有推薦的調(diào)整濃度。 ?。?）不合格標(biāo)本 不合格標(biāo)本包括：標(biāo)本凝血；抗凝劑使用錯(cuò)誤（如使用了EDTA或肝素）；血抗凝劑的比例不是9：1；使用了活性表面的容器或不適宜用于檢測(cè)的容器。 一般來(lái)說(shuō)標(biāo)記錯(cuò)誤或沒(méi)有標(biāo)記的標(biāo)本都是不合格的。但是如果實(shí)驗(yàn)室管理者授權(quán)或者臨床醫(yī)師有約定，標(biāo)本可以檢測(cè)，但是需要遵守一定的程序。所有的非常規(guī)檢測(cè)的申請(qǐng)都必須有記錄。每項(xiàng)檢測(cè)的標(biāo)本可接受標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該是實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)程的一部分。 6、分子止血檢測(cè)的標(biāo)本采集技術(shù) 分子止血檢測(cè)的DNA可從全血細(xì)胞標(biāo)本或口腔涂片中獲得。靜脈血標(biāo)本應(yīng)該直接收集到含有適當(dāng)抗凝劑的真空玻璃管或塑料試管中。正確的操作詳見(jiàn)CLSI H3。口腔涂片必須按照實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作程序采集標(biāo)本。 DNA可從多種標(biāo)本中獲得，包括全血、干血、口腔、唾液和血漿。DNA標(biāo)本的質(zhì)量和分子重量各不相同，取決于標(biāo)本采集、處理、操作和保存技術(shù)。以下關(guān)于標(biāo)本采集的建議只是一般的指南，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該根據(jù)廠商的說(shuō)明采集與試劑盒匹配的標(biāo)本。 ?。?）抗凝劑 血標(biāo)本：抗凝劑的選擇應(yīng)該根據(jù)核酸的來(lái)源、檢測(cè)的項(xiàng)目以及所需的標(biāo)本體積。有研究顯示溶液中存在肝素和血紅素或血紅蛋白可能抑制PCR反應(yīng)。因 此，推薦使用EDTA和酸性檸檬酸鹽葡萄糖（ACD）。此外，標(biāo)本還可以在檸檬酸鈉、凝血或冰凍全血采集。高質(zhì)量的DNA可以從冰凍的全血標(biāo)本中提取，但 需要修飾DNA的提取技術(shù)。有研究報(bào)道可用肝素酶去除標(biāo)本中的肝素。若使用EDTA，核酸在細(xì)胞中的標(biāo)本收集不能使用帶分離膠的試管，否則血細(xì)胞或血小板 會(huì)在分離膠的下層，細(xì)胞中的核酸不能提取出來(lái)。帶分離膠的試管只能用于被測(cè)的核酸在血漿中的樣本。 其他標(biāo)本：DNA也可在口腔、唾液、干血中提取。所使用的拭子或?yàn)V紙應(yīng)該經(jīng)過(guò)處理，以防細(xì)菌生長(zhǎng)抑制核酸酶的活性。 ?。?）不合格的血標(biāo)本： 不合格的血標(biāo)本包括：標(biāo)記不恰當(dāng)；抗凝劑使用不恰當(dāng)；疑混有其他標(biāo)本。 一般來(lái)說(shuō)標(biāo)記錯(cuò)誤或沒(méi)有標(biāo)記的標(biāo)本都是不合格的。但是如果實(shí)驗(yàn)室管理者授權(quán)或者臨床醫(yī)師有約定，標(biāo)本可以檢測(cè)，但是需要遵守一定的程序。所有的非常規(guī)檢測(cè)的申請(qǐng)都必須有記錄。每項(xiàng)檢測(cè)的標(biāo)本可接受標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該是實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)程的一部分。其他信息詳見(jiàn)CLSI MM13。
二、標(biāo)本運(yùn)送 按照美國(guó)疾病預(yù)防和控制中心（CDC）、美國(guó)運(yùn)輸部（DOT）、以及國(guó)際航空運(yùn)輸協(xié)會(huì)（IATA）的有關(guān)規(guī)定包裝和運(yùn)輸?shù)挠泻Σ牧媳涣袨?ldquo;危險(xiǎn)品”，危險(xiǎn)物品可能會(huì)危害健康、安全、財(cái)產(chǎn)或環(huán)境。臨床/診斷標(biāo)本被列為危險(xiǎn)品，必須按照IATA的要求進(jìn)行包裝和運(yùn)輸。 1、用血漿的凝血檢測(cè) 用于凝血檢測(cè)的標(biāo)本應(yīng)保持室溫，按照相關(guān)規(guī)定運(yùn)送，避免造成感染。對(duì)于多數(shù)用血漿的血凝檢測(cè)不推薦使用冰塊，因?yàn)榈蜏乜苫罨疺II因子，損失 vWF因子和破壞血小板。應(yīng)避免高溫或低溫運(yùn)輸。理想情況下，從標(biāo)本采集到運(yùn)送至標(biāo)本處理處應(yīng)該在1小時(shí)內(nèi)。標(biāo)本運(yùn)送可接受的時(shí)間根據(jù)檢項(xiàng)目而定。如對(duì)于 PT檢測(cè)，延誤時(shí)間在24小時(shí)內(nèi)可接受；對(duì)于普通肝素治療監(jiān)測(cè)，由于肝素可以被血小板因子4中和，因此用檸檬酸鹽做抗凝劑時(shí)從標(biāo)本采集到離心的時(shí)間間隔不 能超過(guò)1小時(shí)，用CTAD作抗凝劑不能超過(guò)4小時(shí)。使用氣動(dòng)導(dǎo)管運(yùn)送標(biāo)本時(shí)應(yīng)注意防止震搖，避免蛋白失活或由于標(biāo)本中的泡沫使血小板活化。 若對(duì)標(biāo)本處理有特殊要求應(yīng)告知負(fù)責(zé)的運(yùn)送員。每個(gè)標(biāo)本都應(yīng)有以下信息：運(yùn)送員接收標(biāo)本的時(shí)間、實(shí)驗(yàn)室接收標(biāo)本的時(shí)間和接收時(shí)標(biāo)本大概的溫度。實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)該根據(jù)他們的工作經(jīng)驗(yàn)對(duì)不同標(biāo)本進(jìn)行處理。 2、分子止血檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該根據(jù)廠商提供的試劑盒說(shuō)明和地方、國(guó)家對(duì)標(biāo)本運(yùn)送的規(guī)定進(jìn)行標(biāo)本的收集和運(yùn)送，并且為標(biāo)本運(yùn)送人員提供運(yùn)送說(shuō)明。 標(biāo)本運(yùn)送時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：運(yùn)送人員收到標(biāo)本的時(shí)間、實(shí)驗(yàn)室接收標(biāo)本的時(shí)間及實(shí)驗(yàn)室收到時(shí)標(biāo)本的大概溫度。此外，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)自己的經(jīng)驗(yàn)處理不同類型的標(biāo) 本。詳見(jiàn)CLSI MM13。 ?。?）全血 理想情況下，DNA從新鮮的抗凝（EDTA或檸檬酸）全血標(biāo)本中提取，室溫保存用于檢測(cè)。提取前2-8℃也可保存3天。沒(méi)有研究證據(jù)表明DNA 提取前標(biāo)本最長(zhǎng)能保持多少天，有人報(bào)道可保存長(zhǎng)達(dá)922天。由于自動(dòng)除冰冰箱的溫度在一天內(nèi)循環(huán)改變，可使核酸降解，因此如果血標(biāo)本要冰凍保存不應(yīng)使用自 動(dòng)除冰冰箱。如果DNA不能在數(shù)天內(nèi)提取，血沉棕黃層細(xì)胞（或壓縮細(xì)胞）可于-80°C保存。 （2）其他標(biāo)本 用于DNA提取的唾液、口腔涂片、口腔沖洗液可保存2年。有研究報(bào)道用于DNA提取和基因分型的干血濾紙片標(biāo)本可保存11天。而保存超過(guò)7天的口腔標(biāo)本不適宜用于基因分型。 三、標(biāo)本處理 1、用血漿的凝血檢測(cè)標(biāo)本處理 離心前，將標(biāo)本輕輕倒置觀察，從整體上檢查標(biāo)本有無(wú)血凝塊。去蓋后插入兩根小木棒看是否能挑出小凝塊。但微小的血凝塊用這些方法都無(wú)法檢查出 來(lái)，如存在則可能對(duì)結(jié)果會(huì)產(chǎn)生影響。為獲得血漿標(biāo)本，以產(chǎn)生低血小板（PLT<10 000/μL）的血漿所需的離心速度和時(shí)間進(jìn)行離心。離心時(shí)應(yīng)采用水平轉(zhuǎn)子以免血漿污染血小板或其他血細(xì)胞，特別是血漿移去后標(biāo)本還要用于其它檢測(cè)或者冰 凍保存。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)各自的條件做一定的試驗(yàn)來(lái)確定最佳的離心時(shí)間和速度，通常來(lái)說(shuō)在室溫下1500g不小于15分鐘。也可用被稱作“statfuge” 的高速短時(shí)間離心。為了保證離心后的血小板計(jì)數(shù)在可接受范圍內(nèi)，每6個(gè)月或離心設(shè)定改變應(yīng)該對(duì)離心程序的可靠性進(jìn)行確認(rèn)。兩次離心可確保血小板減少到規(guī)定 數(shù)量，在初次離心后用塑料吸頭將血漿轉(zhuǎn)移到另一個(gè)非活性表明的塑料離心試管中進(jìn)行第二次離心。在吸取第一次離心后的血漿時(shí)應(yīng)注意避免將管底的血小板吸入第 二次離心的試管。 血漿樣本可通過(guò)0.2-μm過(guò)濾器過(guò)濾以達(dá)到減少血小板的目的。但是這種方法并不適用于所有的血凝檢測(cè)。由于過(guò)濾選擇性的去除了V、VIII、 IX、XII和vWF從而使APTT結(jié)果延長(zhǎng)?？紤]到這一點(diǎn)，不推薦使用過(guò)濾器的方法。少血小板的血漿對(duì)于冰凍后進(jìn)行的檢測(cè)十分關(guān)鍵，但是若用新鮮血漿作 為檢測(cè)APTT、PT/INR和TT時(shí)，血小板含量達(dá)200 000/μL也不影響檢測(cè)結(jié)果。 不管是用光學(xué)的還是機(jī)械的終點(diǎn)檢測(cè)體系，不能使用肉眼可見(jiàn)溶血的標(biāo)本，溶血標(biāo)本的凝血因子可能被激活，從而影響檢測(cè)結(jié)果。由于溶血標(biāo)本對(duì)透光率有干擾，所以使用光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)的影響更大。對(duì)疑似有血紅蛋白存在的標(biāo)本，又不是拒收標(biāo)本，最好使用機(jī)械終點(diǎn)檢測(cè)系統(tǒng)。 光學(xué)終點(diǎn)檢測(cè)的儀器容易受到黃疸、血脂或者其他干擾透光率物質(zhì)的影響。有人建議使用超離心來(lái)解這個(gè)問(wèn)題，但是還沒(méi)有公開發(fā)表的文獻(xiàn)。有些未發(fā)表 的研究顯示對(duì)于脂質(zhì)樣本，PT和APTT值會(huì)減少，纖維蛋白原水平增加10-15%。在有研究公開發(fā)表或?qū)嶒?yàn)室在對(duì)這一程序確認(rèn)之前，盡量使用機(jī)械或電學(xué) 方法檢測(cè)黃疸、脂質(zhì)或含其他干擾透光率物質(zhì)的標(biāo)本。 2 分子止血檢測(cè)標(biāo)本處理 DNA檢測(cè)的核酸標(biāo)本準(zhǔn)備有很多方法，這一步對(duì)最終的檢測(cè)結(jié)果十分關(guān)鍵。不管檢測(cè)方法是自己制定，還是參考文獻(xiàn)從廠商購(gòu)買都應(yīng)該確保有一個(gè)可接 受的協(xié)議可遵循。在整個(gè)性能核查過(guò)程中都應(yīng)該使用已確認(rèn)的方法并遵循相應(yīng)的協(xié)議。然而很多方法在協(xié)議和使用的材料方面不相同。不管是用什么程序，保持臨床 標(biāo)本中核酸的整體性很重要。同樣也應(yīng)該在最后的標(biāo)本準(zhǔn)備過(guò)程中充分稀釋不純的物質(zhì)以消除檢測(cè)的干擾。 要記錄所用方法的程序，包括用于DNA純化的物質(zhì)的來(lái)源。若有變動(dòng)應(yīng)經(jīng)實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人同意并記錄下來(lái)。關(guān)于檢測(cè)設(shè)計(jì)、準(zhǔn)備和操作程序的維護(hù)詳見(jiàn)CLSI/NCCLS GP2。更多關(guān)于標(biāo)本處理的信息見(jiàn)CLSI/NCCLS MM1。 （1）DNA分離 傳統(tǒng)的DNA分離需要溶解細(xì)胞和蛋白溶解酶，如蛋白激酶K，消化結(jié)合在DNA上的蛋白質(zhì)。然后用RNA酶破壞RNA，有機(jī)溶劑出去殘留的蛋白和 細(xì)胞的其他成分，最后用乙醇沉淀DNA。純化的DNA可用離心或玻璃棒攪拌收集，然后Tris緩沖液中懸浮。應(yīng)避免過(guò)分的干燥，否則影響DNA結(jié)構(gòu)完整 性。商業(yè)的試劑可簡(jiǎn)化核酸分離步驟，減少所需時(shí)間。各方法所使用的試劑程序都不同。很多試劑盒使用其他物質(zhì)替代有機(jī)溶劑和乙醇可以減少危害。實(shí)驗(yàn)室在將 DNA純化體系用于常規(guī)工作時(shí)應(yīng)對(duì)其效率、兼容性和DNA純化進(jìn)行評(píng)估。 ?。?）用于擴(kuò)增的DNA分離 Southern印記比PCR或其他擴(kuò)增方法對(duì)DNA制備要求高。這些檢測(cè)都需要高純度的DNA，參考文獻(xiàn)中的方法或使用快速試劑盒很方便且經(jīng) 濟(jì)。一般簡(jiǎn)短的方法可用小體積的血液或其他來(lái)源的細(xì)胞。在大多數(shù)情況下用蛋白酶K、堿、Tris緩沖液裂解細(xì)胞。然后中和裂解產(chǎn)物，離心去除細(xì)胞碎片。裂 解液可直接用于擴(kuò)增。關(guān)于DNA分離詳見(jiàn)CLSI/NCCLS MM5。 四、標(biāo)本保存 1、用血漿的凝血檢測(cè)標(biāo)本保存 ?。?）短期保存 標(biāo)本從采集到檢測(cè)的可允許時(shí)間間隔取決于檢測(cè)項(xiàng)目以及運(yùn)送和保存的溫度。血凝檢測(cè)的標(biāo)本應(yīng)該戴帽保存，盡快檢測(cè)。保存可參照以下指南。 PT：PT檢測(cè)的標(biāo)本可以不離心保存，也可以離心后將血漿置于細(xì)胞成分上面封閉保存，室溫條件下可保存24小時(shí)。標(biāo)本的穩(wěn)定性取決于檢測(cè)系統(tǒng) （凝血活酶試劑、儀器和收集容器）。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)該確認(rèn)其檢測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。全血標(biāo)本應(yīng)該室溫保存，避免機(jī)械攪拌，否則會(huì)使PT/INR值偏高，其機(jī)制 不明。采集標(biāo)本后迅速離心可保持室溫下標(biāo)本的完整性。不推薦將標(biāo)本保存在2-4℃，以免激活VII因子使PT檢測(cè)結(jié)果改變。此外，除非反應(yīng)試劑中含有肝素 中和劑，否則保存時(shí)間可改變用肝素或茴香豆素治療的患者標(biāo)本PT值。 APTT：不含肝素的APTT常規(guī)檢測(cè)標(biāo)本可以不離心保存，也可以離心后將血漿置于細(xì)胞成分上面封閉保存，室溫條件下可保存4小時(shí)。若實(shí)驗(yàn)室需要將標(biāo)本保存4小時(shí)以上，則應(yīng)該進(jìn)行室內(nèi)評(píng)估。評(píng)估應(yīng)包括正常和異常的APTT標(biāo)本凝血因子的活性（V和VIII）檢測(cè)。 APTT- vWF：若要檢測(cè)凝血因子VIII和vWF因子活性的標(biāo)本在室溫下保存更好，不應(yīng)保存在2-4°C，因?yàn)榈蜏乜墒鼓蜃覸III和vWF因子的活性逐漸喪失，導(dǎo)致誤診為凝血因子VIII缺乏或vWF因子相關(guān)疾病。 APTT-UFH：可能含有普通肝素（unfractionated heparin，UFH）的標(biāo)本應(yīng)該在室溫保存，采集標(biāo)本后1小時(shí)內(nèi)離心，在4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。若不能在1小時(shí)內(nèi)離心，用CTAD可以提高其穩(wěn)定性。但是需測(cè)定基質(zhì)的治療性APTT肝素范圍。 APTT-其他：T用于其它檢測(cè)的標(biāo)本（如抗Xa因子、TT、蛋白C和V因子）應(yīng)該室溫保存，在標(biāo)本采集后4小時(shí)內(nèi)離心檢測(cè)。盡管現(xiàn)在支持將血漿與細(xì)胞成分分離的數(shù)據(jù)很有限，但仍然推薦使用這種做法。若實(shí)驗(yàn)室需要將標(biāo)本保存4小時(shí)以上，則應(yīng)該進(jìn)行室內(nèi)評(píng)估。 如果PT檢測(cè)的標(biāo)本不能在24小時(shí)內(nèi)完成，APTT檢測(cè)不能在4小時(shí)內(nèi)完成，則避免搖起底層的細(xì)胞，應(yīng)該將少血小板的血漿轉(zhuǎn)移在-20℃以下短 期保存，在-70℃以下長(zhǎng)期保存。保存時(shí)應(yīng)該使用手動(dòng)除冰的冰箱，不適宜用周期性自動(dòng)除冰冰箱，否則會(huì)激活VII因子。冰凍標(biāo)本應(yīng)在37℃下迅速解凍，溫 和混勻后馬上檢測(cè)?；靹蚴顷P(guān)鍵，某些蛋白質(zhì)沉淀可能出現(xiàn)凍結(jié)。
（2）長(zhǎng)期保存 與標(biāo)本的短期保存相比較，關(guān)于血凝標(biāo)本的長(zhǎng)期保存的文獻(xiàn)較少。長(zhǎng)期保存的數(shù)據(jù)也是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來(lái)定的，缺乏科學(xué)的研究。已發(fā)表的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)大部分來(lái)源 于血庫(kù)和輸血科。這些機(jī)構(gòu)做的血凝檢測(cè)較少，標(biāo)本通常保存在CPDA或CPD抗凝劑中而不是檸檬酸鹽。Woodhams等報(bào)告了24個(gè)月保存的冰凍血漿的 穩(wěn)定性。在這篇研究中，血標(biāo)本從6個(gè)正常捐獻(xiàn)者通過(guò)血漿去除術(shù)采得，然后將標(biāo)本保存在0.129M的檸檬酸緩沖液中。將每個(gè)捐獻(xiàn)者的血漿分裝到1 mL和3mL保存試管中（使死腔最?。?。然后評(píng)估5種冰凍條件和兩種長(zhǎng)期保存溫度（-24℃和-74℃）下的18項(xiàng)血凝檢測(cè)，包括4項(xiàng)篩查檢測(cè)、8個(gè)凝血 因子、4項(xiàng)功能檢測(cè)和2項(xiàng)免疫檢測(cè)。 這項(xiàng)研究的數(shù)據(jù)為我們提供了長(zhǎng)期保存標(biāo)本的指南，見(jiàn)表2。從表中可看出，若將血漿標(biāo)本初次檢測(cè)與低溫下保存后檢測(cè)的變異控制在±5%，標(biāo)本可在 0.129 M的檸檬酸鹽在-24℃保存3個(gè)月，超過(guò)3個(gè)月則需在-74℃以下保存。在-74℃下所有的檢測(cè)項(xiàng)目的變異都在±10%內(nèi)，至少可以保持18個(gè)月的穩(wěn)定 性。
以上數(shù)據(jù)為我們提供了長(zhǎng)期保存標(biāo)本的指南，但是必須考慮以下因素對(duì)血漿長(zhǎng)期穩(wěn)定性的影響因素。首先，研究中使用的是體積較大的血漿去除器采集標(biāo) 本，而常規(guī)使用的是較小的靜脈采血。其次，研究使用的是正常捐獻(xiàn)者的標(biāo)本，沒(méi)有評(píng)估患者標(biāo)本。最后，研究不是使用CLSI推薦的0.105-0.109M 的檸檬酸鈉作抗凝劑。 ?。?）不合格標(biāo)本 以下標(biāo)本不適合用于檢測(cè)：凝血；抗凝劑使用不當(dāng)；血液抗凝比例不當(dāng)；沒(méi)有標(biāo)記或標(biāo)記錯(cuò)誤；使用的容器不當(dāng)；嚴(yán)重溶血；全血標(biāo)本在處理前冰凍；用于PT檢測(cè)的全血樣本在檢測(cè)前放入冰箱；用于vWF或VIII因子檢測(cè)的全血樣本在處理前放入冰箱。 2 用于分子止血檢測(cè)的標(biāo)本保存 DNA是相對(duì)穩(wěn)定的大分子物質(zhì)。一旦分離成功，可在2-8℃下保存至少1年，在-80℃以下可保存更久。DNA一般保存在溶液中，用于PCR或 限制性內(nèi)切酶消化的DNA可保存在雙蒸水中。Tris/EDTA （pH7.2）被認(rèn)為是最佳的DNA保存溶液，因?yàn)榫彌_液可限制PH的變異，在水中可導(dǎo)致DNA的自發(fā)降解。核酸在溶液中長(zhǎng)期冰凍保存不會(huì)影響其特性。若 要保存的DNA經(jīng)常要用來(lái)檢測(cè)，可分裝保存。分裝保存既可以避免重復(fù)凍溶對(duì)DNA的影響，也可以避免污染。 ?。?）長(zhǎng)期保存純化DNA的建議 0℃以下可抑制DNase的活性，DNA可長(zhǎng)期保存（至少1年）。純化的DNA應(yīng)保存在戴帽的、不透水的塑料試管中，放置一個(gè)橡膠墊可防止蒸 發(fā)。聚丙烯試管可能吸附DNA，特別是在高離子強(qiáng)度下。聚乙烯試管吸附DNA的能力比聚丙烯更強(qiáng)。經(jīng)過(guò)特殊設(shè)計(jì)的聚丙烯試管或異質(zhì)同晶聚材料試管特別適合 DNA的保存。 純化的DNA保存在Tris-EDTA (TE )中，若不存在Dnases污染，室溫下可保存26周；2-8℃至少可保存1年；-20℃下可保存7年；-70℃下至少可保存7年。不是很純的DNA最好 保存在-20℃以確保DNA的完整性。用于DNA保存的冰箱不能使用自動(dòng)除冰冰箱，因?yàn)檠h(huán)的溫度變化可能導(dǎo)致核酸的降解。 ?。?）不合格標(biāo)本 以下標(biāo)本不適合用于檢測(cè)：沒(méi)有標(biāo)記或標(biāo)記錯(cuò)誤；懷疑有其他標(biāo)本污染；溶血或使用抗凝劑不當(dāng)；口腔涂片拭子有水分跡象或有細(xì)菌或真菌生長(zhǎng)的跡象。 |
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